analytical chemistry
یک روش جدید که کارایی دستگاه اسپکتروفتومتر رو انجام میدهد ولی نیاز به دستگاه ندارد.این روش تحقیقاتی توسط اینجانب انجام شده و نتایج قابل قبولی به دست امد.

به زودی منتظر این خبر جدید باشید.

+ نوشته شده در  یکشنبه یازدهم اردیبهشت 1390ساعت 5:23  توسط esmaeil | 
 
nبه سبب مطالعه بیومولکول ها اعم از اسید های نوکلئیک یا پروتئین ها ابداع شده است
nالكتروفورز روشي است كه در آن نمونه هايي که بار الکتريکي دارند، تحت تأثير يك ميدان الكتريكي از ميان شبکه اي متخلخل حركت مي کنند. سرعت حرکت مولکولها در اين شرايط نه تنهاتحت تاثير بار الکتريکي اشان است بلکه عواملي ديگري نظير اندازه و شکل مولکول نيز در اين امر دخيل هستند.
nبه همين دليل الکتروفورز روشي مناسب و کارآمد در جداسازي مولکول مورد استفاده قرار مي گيرد. معمولا" الکتروفورز براي جداسازي مولکولهاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود, اما در مواردي نيز براي جداسازي مولکولهاي باردار کوچکتري نظير قندها, اسيدهاي آمينه, پپتيدها و حتي يونهاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
nمعمولا" براي الکتروفورز يک مخلوطاینکه ماکرومولکول های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود. روش های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و و مولکولي, لايه نازکي از آن, بر روي شبکه اي متخلخل که محلولي را درون خود محبوس کرده است, قرار داده مي شود. پس از برقراي ميدان الکتريکي با اِعمال اختلاف پتانسيل در دو سوي اين شبکه, مولکولهاي موجود در نمونه با سرعت هاي متفاوتي درون شبکه متخلخل شروع به حرکت مي کنند
nاين اختلاف سرعت مبناي جداسازي در الکتروفورز است. در پايان, مولکولهاي پروتئيني مختلف به صورت باند هايي مجزا در قسمت هاي مختلف شبکه آشکار مي شوند. شبکه متخلخل در ممانعت از انتشار مولکولها در اثر گرماي ايجاد شده به خاطر جريان الکتريکي نقش مهمي دارد. علاوه بر اين در مواردي که از ژل هاي آگاروز و پلي آکريل آميد استفاده مي شود, شبکه متخلخل نقش يک الک غربال کننده بر اساس اندازه مولکولها را نيز ايفا مي کند.
nاغلب دستگا ه هاي الکتروفورز, ژل مابين دو محفظه ي بافري قرار مي گيرد به طوريکه ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته بين اين دو محفظه باشد (شکل زیر)
nجداسازي توسط الکتروفورز تحت تاثير عوامل متعددي قرار دارد. ماهيت مولکولهاي نمونه نظير بار الکتريکي و اندازه آنها و شدت جريان و ميدان الکتريکي و بالاخره اثرات محيطي نظير نوع و نحوه ي استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين کار عواملي هستند که بر نحوه ي جداسازي مولکولهاي نمونه اثر مي گذارند
n-  اثر عوامل الکتريکي
nقانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است P=V2/R يا P=I2R يا P=VI معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است
 
n-  اثر عوامل الکتريکي
nقانون اهم؛ V ولتاژ يا اختلاف پتانسيل برحسب ولت, I شدت جريان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است P=V2/R يا P=I2R يا P=VI معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است
nاين حرارت ايجاد شده بر اثر مقاومتي است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرماي ژول Joule heat موسوم است. منابع الکتريکي Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ايجاد جريان مستقيم مي کنند و معمولا" يکي از پارامترهاي الکتريکي,يعني ياجريان يا اختلاف پتاتسيل يا توان را ثابت نگاه مي دارند.
nبايد توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمي توان ثابت نگاه داشت. براي مثال در حين الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرماي ژول, کاهش مي يابد
nبنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر الکتريکي که ثابت نگاه داشته مي شود, گرماي ژول در حين انجام الکتروفورز ممکن است کاهش يا افزايش يابد. براي مثال در "SDS-PAGE" ناپيوسته ثابت نگاه داشتن شدت جريان منجر به افزايش دما مي شود که نياز به سيستم خنک کننده را در چنين وضعيتي الزامي مي کند
nانتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتريکي در حين الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغير هاي مختلفي صورت مي پذيرد. براي مثال مدت زمان مورد نظر براي انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعاليت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ مي دهد, و نياز به حفظ دماي خاص براي انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئين ها با جريان ثابت الکتروفورز مي شوند, در حاليکه الکتروفورز اسيد هاي نوکلئيک با ولتاژ ثابت انجام مي شود
n- اثر سيستم هاي بافري و pH
nپروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH  محيطي که در آن قرار داشته باشند بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند. بدين ترتيب در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH  محلول هاي  مورد استفاده ثابت باقي بماند از آنجا که الکتروليز آب در آنود يونهاي "H+" و در کاتود يونهاي "OH-" ايجاد مي کند, براي ثابت نگاه داشتن pH محلولهاي مورد استفاده, آنها بايد بافر شوند
n- اثر حرارت
nبراي حفظ تکرار پذيري, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسيار مهم است. براي مثال پلي مريزه شدن آکريل آميد يک واکنش گرمازا است, از اينرو گرماي ايجاد شده در حين پلي مريزاسيون, به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بي نظمي در اندازه ي منافذ ژل گردد
nانتقال گرما معمولا" مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر از 15% T نمي کند. به هر حال گرماي زياد در حينالکتروفورز مشکلات ديگري را نيز پديد مي آورد؛ شکستن شيشه هاي الکتروفورز, آسيب به دستگاه. وقتيکه حرارت بصورت يک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهاي جدا شده نامنظم � شود و در اصطلاح باندها خندان مي شوند چون نمونه ها در رديف هاي وسط سريع تر از رديف هاي کناري حرکت خواهند کرد
nالکتروفورز یک روش جدا سازی مبتنی برسرعت تفاضلی گونه های بار دار در یک محلول بافر هست
nکه در عرض ان یک میدانه الکتریکیdcاعمال شده است
nاین فن جدا سازی ابتداع توسط یک شیمیدان سوئدی برای مطالعه پروتئین های سرم ابداع شد.
nانواع الکترو فورز:
n1-الکتروفورز ورقه ای
n2-الکترو فورز مویینه ای
n3-الکتروفورز ژل
nالکتروفورز ورقه ای
nاین یک روش کلاسیک است که برای جداسازی گونه های پیچیده با وزن مولکولی زیاد زیست شناختی وزیست شیمیایی مورد استفاده قرار گرفته است.
nجدا سازی های ورقه ای روی یک لایه یایک ورقه صاف باریک از یک ژل نیمه جامد متخلخل حاوی یک محلول بافر ابی در درون منافذ ان انجام میشود
nاین ورقه ابعادی در حدود چند سانتی متر در هر کناره دارد و مانند یک صفحه نازک کرو ماتو گرافی می تواند چند نمونه را همزمان جدا کند.
nدر این روش نمونه ها به صورت لکه ها یا نوارها روی ورقه وارد میشوند و سپس یک پتانسیل dcدر طول ورقه برای مدتی ثابت اعمال میشودسپس با کامل شدن جداسازی جریان قطع می شودو گونه های جدا شده به وسیله رنگ دار کردن شناسایی میشود
nاین روش یک روش دستگاهی نیست و در حال حاضر متداولترین وسیله جدا سازی برای زیست شیمیدان هاو زیست شناسان می باشد.این نوع روش جدا سازی کند و وقت گیر است واطلاعات کمی بسیار دقیقی در اختیار نمی گذارد
nاساس جداسازی الکترو فورزی
n.سرعت مهاجرت یک یون بر حسب سانتی متر بر ثانیه در یک میدان الکتریکی برابر است با حا صلضرب قدرت میدانEوتحرک الکترو فورزی.
nتحرک الکترو فورزی به نوبه خود تناسب مستقیم با بار یونی روی انالیت دارد.میدان الکتریکی تنها روی یون ها اثر دارد در صورتی که دو گونه از نظر بارتفاوت داشته باشند از یک دیگر جدا می شوند.گونه های خنثی جدا نمی شوند.
nبرای یون ها با بار یکسان هر چقدر یون کوچک تر با شدنیرو های اصطکاکی کوچکترو سرعت مهاجرت بیشتر است.برای یون ها با اندازه یکسان هر چقدر بار بیشتر باشد نیروی رانشی بیشتر است و سرعت مها جرت بیشتر است.
nالکترو فورز مویینه ای
nاین روش یک روش دستگاهی می باشد.الکتروفورز مویینه ای جدا سازی های با تفکیک  زیادوسرعت بالاروی حجم های به ویژه کوچک (0.1تا10نانو لیتر بر عکس الکترو فورز ورقه ای که به نمو نه های در گستره میکرو لیتر نیاز دارد)در اختیار می گذارد.
nدر این روش گونه های جدا شده از یک انتهای مویین شوییده می شوند به نحوی که اشکار سازهای کمی مانند اشکار ساز های HPLCرا می توان به جای فنون رنگ زنی پر در دسر الکترو فورز ورقه ای به کار برد
nسرعت مهاجرت و ارتفاع بشقابک در الکتروفورز مویینه ای
nسرعت مهاجرت یک یون به قدرت میدان الکتریکی بستگی داردو همچنین میدان الکتریکی به نوبه خود به وسیله بزرگی پتانسیل اعمال شده بر حسب ولت وطول Lکه میدان در ان اعمال میشود تعیین می گردد
nبرای به دست اوردن مهاجرت یونی سریع و یک جدا سازی سریع پتانسیل های اعمال شده بالایی مطلوب است.بهتر است جدا سازی های سریع داشته باشیم ولی مهمتر این است که جدا سازی با تفکیک بالا بدست اوریم.
nجریان الکترو اسمزی
nهنگامی که یک پتانسیل زیاد در عرض یک لوله مویین حاوی یک محلول بافر اعمال شود جریان الکترو اسمزی معمولا به وجود می اید که در ان حلال به طرف کاتد یا اند حر کت میکند سرعت مهاجرت می تواند قابل توجه باشد مثلا مشاهده شده است که یک بافرmM50 با 8=PH از درون یک لوله مویین 50 سانتی متری با پتانسیل اعمال شده ای برابر KV25 به طرف کاتد جریان میابد.با توجه به شکل زیر  علت جریان الکترو اسمزی لایه مضاعف الکتریکی است که در سطح مشترک سلیس/محلول ظاهر میشود
nبالای 3=PH دیواره درونی مویین سلیسی  به صورت یونش گروه سیلا نول سطحی Si-OHبار منفی دارد.کاتیون های بافر در یک لایه مضاعف الکتریکی مجاور با سطح منفی مویین سیلیسی جمع می شوند کاتیون ها  در لایه بیرونی نفوذ لایه مضاعف به طرف کاتد  یا الکترود منفی جذب میشوند واز انجا که کاتیون ها ابپوشیده هستند حلال توده را همراه با خود می کشد.
nترتیب شویش در یک جدا سازی الکتروفورزی مویینه ای نوعی ابتدا سریعترین کاتیون ها و متعاقب ان کاتیون های کندتروسپس تمام مواد خنثی در یک منطقه تک ودر نهایت کندترین انیون ها وبه دنبال ان انیون های سریعتر است.در برخی موارد سرعت جریان الکترواسمزی ممکن است به حد کافی زیاد نباشد تا از سرعتی زیاد تر شود که در ان برخی از انیون ها به طرف اند حرکت می کنند.که در این صورت این گونه ها به طرف اند حرکت می کنند.
nمی توان جهت جریان الکترواسمزی نرمال را با افزودن یک عامل فعال در سطح کاتیونی به بافر معکوس کرد.عامل فعال در سطح روی دیواره مویین جذب سطحی می شودو به دیواره ها بار مثبت می دهد سپس انیون های بافر نزدیک به دیواره تجمع میکنندوبه طرف کاتد یا الکترود مثبت جاروب میشوند این عمل اغلب برای سرعت بخشیدن به جدا سازی انیون ها به کار گرفته میشوند.جریان الکترواسمزی را میتوان به وسیله اندودن دیواره مویین با واکنشگری مانند تری متیل کلرو سیلان جهت حذف گروهای  سیلا نول سطحی حذف کرد.
nدستگاهوری  برای الکترو فورز مویینه ای
nدر این دستگاه یک مویین سیلیس جوش خورده پر شده با بافر که قطر درونی ان نوعا 10 تا 100 میکرو متر وطول ان 40 تا 100 سانتی متر است وبین دو مخزن بافر قرار داردکه الکترودهای پلاتینی در انها فرو رفته است نمونه در یک انتهای لوله وارد می شودویک پتانسیلdc در گستره 20 تا 30 kv بین دو الکترود طی جدا سازی اعمال میشود انالیت های جدا شده به وسیله اشکار سازی که در انتهای دیگر ستون قرار گرفته است مشاهده میشود.
nروش های وارد کردن نمونه
n1-تزریق الکترو سینتیکی
n2-2-تزریق فشاری
nتزریق الکتروسینتیکی
nدر تزریق الکترو سینتیکی یک انتهای مویین و الکترود ان از محفظه بافری خود برداشته ودر فنجان کوچکی حاوی نمونه قرار داده می شود.سپس پتانسیلی برای زمان مشخص اعمال میشود تا به وسیله ترکیبی از مهاجرت یونی و جریان الکترو اسمزی باعث وارد شدن نمونه به درون مویین شود.سپس انتهای مویین و الکترود ان مجددا به درون محلول بافر برای مدت جداسازی بر گردانیده میشوداین فن تزریق بین تزریق مقادیر بیشتری از یون ها با تحرک بیشتر در مقایسه با یون ها ی با حرکت کندتر تمایز قائل میشود.
nتزریق فشاری
nدر تزری فشاری انتهای وارد شدن نمونه مویین نیز مو قتا در یک فنجان کوچک حاوی نمو نه قرار داده میشودوسپس اختلاف فشاری به کار میرود تا محلول نمونه را به درون مویین براند.این اختلاف فشار میتواند با اعمال خلا در انتهای اشکار ساز به وسیله تحت فشار قرار دادن نمونه یا به وسیله بالا بردن انتهای نمونه حاصل شود.تزریق فشاری به علت تحرک یونی تمایزی قائل نمیشود.ولی نمی توان ان را در مویین های پر شده با ژل بکار برد.
nهم برای تزریق فشاری هم برای تزریق الکتروسینتیکی حجم تزریق به وسیله  طول مدت تزریق کنترل می شود. میزان تزریق نمونه nL50 - 5 می باشد. و حجم های زیرpL00 1 نیز گزارش شده است
nاشکارسازها
n جذبی
nفلورسانس
nاسپکتروسکوپی جرمی
nالکتروشیمیایی ( امپرومتری - هدایت سنجی)
nطراحی و عملکرد اشکار سازها مشابه اشکارسازهای HPLC میباشد در الکتروز مویینه ای هر یون در سرعتی مهاجرت میکندکه به وسیله تحرک الکتروفورزی ان تعین می شود بنابراین نوارهای انالیت ها در سرعت های متفاوتی از درون اشکار ساز عبور میکند وبه مساحت پیک های منجر میشود که تا حد زیادی به زمان بازداری وابسته اند در مقابل در HPLC تمتم گونه ها در سرعت فاز متحرک از درون اشکار ساز عبور می کنند ومساحت پیک ها مستقل از زمان بازداری است.
nاشکار سازهای جذبی
nاین اشکار ساز جزء عمومی ترین اشکارسازها به حساب می اید و معمولا جزء استاندارد دستگاههای CE می باشد. حجم اشکارسازی در حد نانولیتر می باشد. متاسفانه طول مسیر برای چنین اندازه گیری هایی بیشتر ازμm 100- 50 نمی باشد و باعث می شود که حد تشخیص به ترم غلظت محدود شود
nبرای بهبود حساسیت اندازه گیری جذبی چند فن برای افزایش طول مسیر اندازه گیری ها استفاده میشود.
n1-ایجد حباب نزدیک به انتهای مویین
n2-خم کردن انتهای مویین به شکل “Z”
nاستفاده از بازتابش(در این تکنیک پوشش انعکاسی از نقره روی انتهای موئین ته نشین می شود. در این حالت شعاع تابشی انعکاسات زیادی را متحمل می شود تا از موئین خارج شود در نتیجه طول مسیر افزایش می یابد)
nاشکار سازی جذبی غیر مستقیم
nاشکار سازی جذبی غیر مستقیم برای اشکار سازی گونه هایی به کار گرفته میشود که به علت ضرایب جذب مولی کم بدون مشتق سازی اشکار سازی انها مشکل  است.در این روش یک رنگ ساز یونی در بافر الکترو فورز قرار داده میشود.سپس اشکار ساز یک علامت ثابت مربوط به حضور این جسم دریافت می کند.انالیت جایگزین برخی از این یون ها میشود درست همانند کرو ماتو گرافی تبادل یونی  به نحوی که علامت اشکار ساز طی عبور یک نوار انالیت از درون اشکارساز کاهش می یابد سپس انالیت از کاهش در جذب اندازه گیری می شود.
nاشکار سازی فلوئورسانی
nمانند HPLC اشکار سازی فلوئورسانی حساسیت وگزینش پذیری فزایندهای برای تجزیه های فلورسانی یا مشتقات فلوئو رسانی به دست میدهد.اشکار سازی فلوئورسانی لیزری امکان اشکار سازی تنها 10 زپتومول یا 600 مولکول را میسر میسازد.
nاشکار سازی الکترو شیمیایی
nدو نوع اشکار ساز ی الکتروشیمیایی با الکترو فورز مویینه ای به کار گرفته شده است.
n1- رسانندگی
n2-امپرسنجی
nیکی از مشکلات با اشکارسازهای الکتروشیمیایی مجزا کردن الکترودهای اشکارساز از پتانسیل بالای مورد نیاز برای جداسازی می باشد.                                       یک روش برای از بین بردن این مشکل قرار دادن یک شیشه متخلخل یا اتصال گرافیت بین انتهای موئینگی و موئینگی دوم که شامل الکترودهای دتکتور می باشد است.
nاشکار ساز طیف سنجی جرمی
nبیولوژیستها و بیوشیمیدانها برای بدست اوردن اطلاعات ساختاری (ماهیت مولکولهای بزرگ) مانند پروتئینها ٬ پپتیدها و تکه های DNA از این نوع اشکارساز استفاده می کنند.حدود اشکار سازی نوعی برای طیف سنج جرمی /الکتروفورز در حدود ده فمتومول برای مولکول های با وزن مولکولی 100000 یا بیشتر است. 
n       
nکاربرد های الکترو فورز مویینه ای
nجداسازی های الکترو فورزی مویینه ای به چند طریق به نام شیوه انجام می گیرد.این شیوه ها ابتدا در الکتروفورز ورقای اتجام شدند وسپس برای جداسازیهای الکترو فورزی مویینه ای تطبیق داده شدند.این شیوه ها عبارت از:
n1- الکترو فورز ناحیه –مویین(CZE  )
n2-الکترو فورز ژل – مویین(CGE)
n3-تمرکز ایزو الکتریک مویین(CLEF)
n4-ایزو تاکافورز مویین(CITP)
nالکترو فورز منطقه مویین
nدر الکترو فورز منطقه مویین ترکیب بافر در سرتاسر ناحیه جداسازی ثابت است.پتانسیل اعمال شده باعث می شود تا اجزای یونی متفاوت مخلوط هر یک بر طبق تحرک خود مهاجرت کنندوبه منطقه هایی جدا شوند که ممکن است به طور کامل تفکیک شوند یا ممکن است به طور جزئی همپوشانی کند.این وضعیت مشابه کروماتو گرافی ستونی شویشی می باشد.
nایزو تاکوفورز مویینه ای
nدر ایزو تاکوفورز مویینه ای تمام ننوارهای انالیت در نهایت با سرعت یکسانی حرکت می کنند.کاتیون ها و انبون ها را می توان جداسازی کردولی جداسازی هر دو در یک زمان عملی نیست.در یک جداسازی نمونه بین دو بافر تزریق می شود.
nیک بافر جلودار حاوی یون هایی با تحرک زیاد تر از هر یک از یون های انالیت ویک بافر پایان رسان با یون هایی با تحرک کمتراز یون های نموته.
nمثلا در جداسازی انیون ها یون های کلرید با حرکت تند می توانند در بافر جلودارویون های هپتا نوات با حرکت کنددر بافر در پایان رسان وجود داشته باشند.
nبرای جداسازی انیون ها محلول الکترولیت جلودار به اند ومحلول الکترولیت به پایان رسان به کاتد متصل است.
nتمرکز ایزوالکتریک مویینه ای
nتمرکز ایزوالکتریک مویینه ای برای جدایازی گونه های دو خصلتی مانند :امینو اسیدها وپروتیین هایی که حاوی یک گروه کربوکسلیک اسید ضعیف ویک گروه امین بازی ضعیف هستند به کار برده می شود.
nالکتروفورز ژل
nاز یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می‌شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین ها و اسید های نوکلئیک به کار گرفته می‌شود
n-      الکتروفورز با ژل پلي آکريل آميد
nاكثر روش هاي مربوط به تفكيك پروتئين ها كه امروزه از آنها استفاده مي شود بر مبناي الكتروفورز منطقه اي يا ناپيوسته ژل هاي پلي آكريل آميد استوار است . الكتروفورز منطقه اي  روي ژل پلي آكريل آميد تحت عنوان "PAGE" شناخته مي شود. در اين روش از تفاوت وزن مولكولي و بارالکتريکي پروتئين ها به طور همزمان براي تفکيک آنها از يکديگر استفاده مي شود
nاساس اين روش بر مبناي حركت مولکولهاي باردار در يك ميدان الكتريكي مشخص است. مشخصات ميدان الکتريکي نظير اختلاف پتانسيل، فاصلة بين الكترودها ، مشخصات مولکول نظير بار الکتريکي, اندازه و شكل مولكول ، و عوامل ديگري نظير دما و زمان بر نحوه ي انجام اين روش تاثير مي گذارند
nدرسيستم ناپيوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل رديف کننده و ژل تفکيک کننده Resolving  ژل رديف کننده ژلي با طول کم و با منافذ بزرگ است كه در بالاي ژل بلند و با منافذ كوچك تفکيک کننده قرار مي گيرد. در سيستم "Laemmli" ژلهاي رديف کننده و تفکيک کننده با تو جه به تركيب بافريشان نيز ناپيوسته اند
nاين دو پارامتر ; بافرهاي متفاوت و تركيب آكريل آميد متفاوت به نمونه هايي با حجم نسبتاً بزرگ اين اجازه را مي دهد كه در بخش بالاي ژل رديف کننده متمركز شوند پيش از آنكه بواسطة ورود به ژل پائيني تفکيک کننده عمل جداسازي رويشان انجام گيرد
nمزيت مهم ژل رديف کننده توانايي آن در تمركز پروتئين نمونه هاي بسيار رقيق است . اين كار بطور مؤثري تفكيك مراحل بعدي را بهبود مي بخشد چراكه نمونة اصلي در ناحية خيلي باريك و بسيار متمركزي جمع مي شود و همة مولكولهاي پروتئيني جداسازي الكتروفورتيك خود را تقريباً از يك نقطه شروع مي كنند
nرديف شدن  ناشي از ايجاد يك گراديان محدودو با ولتاژ بالا است كه در آن پروتئين ها مقيد به يك ناحية باريك كاملاً متمركز بين يونهاي كلرايد پيشتاز و گلايسين دنباله رو مي شوند. وقتي جريان الكتريكي از نمونه عبور مي كند، يون كرايد از ساير يونها كه حركت آرامتري دارند ( مثلاً گلايسين ) سريعتر مهاجرت مي كند. يون هاي نمونه با حركت حد واسط خود بين يونهاي كلريد و گلايسين كمپرس شده و در نتيجه  يك ناحية باريك يا باندي شكل بسيار متمركز ايجاد مي شود
nبنابراين ژل رديف کننده قادر است  پروتئين ها را بصورت باندي باريك ساندويچ كند. براي انجام جداسازي الكتروفورتيك، پروتئين ها بعد از انباشته شدن روي يكديگر از آن محدوده جدا شوند. تفكيك بدون رديف کردن و با با افزايش ناگهاني pH و كاهش قطرحفرات ژل نيز امكان پذير است . تحت اين شرايط ، يونهاي نمونه به ژل تفکيک كننده مهاجرت كرده و يونهاي عقب دنباله رو ( گلايسين ) متناوباً از يونهاي نمونه پيشي گرفته و جلو مي زنند. بنابراين گراديان ولتاژ نسبتاً ثابتي ايجاد مي شود كه در آن جداسازي الكتروفورتيك نمونه رخ مي دهد.
nنحوه ي ايجاد منافذ با اندازه هاي متفاوت
nژل پلي آكريل آميد محدودة گسترده اي از اندازه هاي حفرات ژلي را دربر مي گيرد .
n
ژل پلي آكريل آميد با پليمريزاسيون آكريل آميد مونومريك و مونومر ايجاد كنندة پيوند متقاطع  Cross linker, بيس آکريل آميد شكل مي گيرند( شکل بعد).
nپليمريزاسيون آكريل آميد و بيس آكريل آميد مي تواند به صورت شيميايي, با  تترامتيل اتيلن ديامين N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) و آمونيوم پرسولفات, يا سيستم فتوشيميايي باشد
nراديكالهاي آزاد پرسولفات كه با حل آمونيوم پرسولفات در آب ايجاد مي شوند مونومر آكريل آميد را فعال كرده و "TEMED" در اين واكنش با انتقال الكترون اين واكنش را كاتاليز مي كند . در عين حال ريبوفلاوين مي تواند در حضور اكسيژن و اشعة UV راديكال آزاد توليد كند . بعضي مواقع از ريبوفلاوين و آمونيوم پرسولفات براي ايجاد راديكالهاي آزاد استفاده مي شود
nاندازة منافذ ژل عامل اصلي در تعيين قدرت تفكيك پروتئين ها و پلي پپتيدها در ژلهاي پلي آكريل آميد است. اندازه ي منافذ با دو پارامتر مشخص مي شوند: محتواي کل ماده ي جامد يا %T ونسبت مونومر ايجاد کننده ي پيوند متقاطع به مونومر آکريل آميد يا %C
nبدين ترتيب پليمرهاي آكريل آميد مي توانند منافذي با اندازه هاي بسيار متفاوتي را ايجاد کنند. با تغيير در غلظت آكريل آميد و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ي منافذ امکان پذير است. براي مثال، با افزايش نسبت پيوندهاي متقاطع ، اندازه ي منافذ كاهش مي يابد. انتخاب دقيق و درست غلظت ژل آكريل آميد براي جداسازي بهينه پروتئين ها در الكتروفورز ضروري است
nنکات ديگري نيز در نحوه ي پلي مريزه شدن موثرند, براي مثال با افزايش دماي پليمريزاسيون، ميزان پليمريزاسيون افزايش مي يابدو اندازه ي منافذ ژل كوچك مي شود. درحاليكه كاهش دماي پليمريزاسيون مي تواند ژلهايي با منافذ بزرگ توليد كند. عواملي كه كارايي تبديل مونومر به پلي مر را تحت تأثير قرار مي دهند نيز مي توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثير قرار دهند. براي مثال ، استفاده از آكريل آميد كيفيت پائين و نيز pH بسيار بالا يا پايين سبب تبديل ناكامل مونومر به پلي مر شده و سبب ايجاد منافذ بزرگي در ژل شود. مواد افزودني ژل نيز مي تواند بطور قابل توجهي ساختار منافذ ژل را تحت تأثير قرار دهدمثلاً اوره 8 مولار سبب ايجاد ژلهايي با منافذ کوچک مي شود, چون سبب تسهيل پليمريزاسيون كامل مي شود
n. به منظور بررسی پروتئین ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئین ها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین ها شده و به آنها متصل می‌شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شو د
nهر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید. برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می‌شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد
nمعمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ‌تر از 500 جفت باز) در صورتیکه هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه 100 جفت باز از آگاروز 3% و برای قطعات حدود 2000 جفت باز از آگارز 8/0 % استفاده می‌شود
n. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب های اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل ها مولکول های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی دی‌ان‌ای استفاده می‌شود.
nالکتروفورز روي ژل SDS-PAGE
nانتخاب سيستم بافري
nبراي درست کردن ژل دو انتخاب وجود دارد
1 – continuous system
2 - discontinuous system
اگر در کل پروسه از يک غلطت و يک نوع بافر و pH استفاده بکنيم روش الکتروفورز continuous ميباشد.
اگر قسمت هاي مختلف پروسه (از نظر غلظت و بافر و pH ) متفاوت باشد روش الکتروفورز ما discontinuous ميباشد
nمثلا براي DNA يک نوع ژل (معمولا با غلظت کم) درست ميکنيم(continuous) اما براي پروتئين (معمولا) دو نوع يکي رقيق (با منافذ درشت) و با pH کمتر از 7 درست ميکنيم که در بالا قرار ميگيرد و نمونه به داخل آن لود ميشود (stacking gel) دومي غليظ و با منافذ کوچکتر و با pH قليائي که در زير قرار دارد و باعث جداسازي پلي پپتيدها ميشود (resolving gel ) از نظر pH بافر نيز ممکن است مخزن بافر بالايي با مخزن بافر پاييني متفاوت باشد
nساختمان ژل :
nژل SDS-PAGE از پليمرهاي آکريلاميد ساخته ميشود که بيس آکريلاميد به صورت نوارهاي عرضي اين پليمر را به طور منظم به هم ارتباط ميدهد طوري که منافذ با قطر معين و يکسان در ژل ايجاد ميشود پليمريزاسيون ژل با اضافه کردن آمونيوم پرسلفات (يا ريبوفلاوين) شروع ميشود و با افزودن TEMED (يا DMAPN ) تسريع ميشود.
TEMED = N,N,N',N' –tetramethyethylenediamine
DMAPN = 3-dimethylamino-propionitrile
nTEMED موجب تشکيل راديکال هاي آزاد از پرسلفات آمونيوم ميشود و اين راديکال ها پليمريزاسيون را باعث ميشوند چون باز آزاد موجود در TEMED براي اين پروسه ضروري است لذا در pH پايين پليمريزاسيون بطئـي است و يا کاملا متوقف ميشود (لذا در مواقعي که سيستم بافري خيلي اسيدي است بايد از کاتاليت هاي مناسب ديگر مثل سلفيت سديم يا اسيد اسکوربيک يا سلفات آهن استفاده شود).
افزايش TEMED (يا APS) سرعت پليمريزاسيون را افزايش ميدهد
nسيستم پليمريزاسيون ريبوفلاوين + TEMED نياز به نور دارد ريبوفلاوين در اثر نور راديکال هاي آزاد توليد ميکند و پليمريزاسيون ژل انجام ميشود
nريبوفلاوين يا آمونيوم پرسلفات کداميک؟
nموقعي که پروتئين native به پرسلفات حساس است در سيستم continuous ميتوان قبل از لود کردن پروتئين جريان را برقرار کرد تا پرسلفات از ژل خارج شود و سپس نمونه را لود نمود اما در سيستم discontinuous وضعيت بافري ژل stacking با اينکار دگرگون ميشود و بهتر است حداقل در ژل stacking به جاي پرسلفات از ريبوفلاوين به عنوان کاتاليزور استفاده کرد.
nوجود اکسيژن محلول در ژل، پليمريزاسيون را مهار ميکند لذا محلول ژل تهيه شده را قبل از اضافه کردن TEMED با استفاده از پمپ مکنده به مدت يک دقيقه degassed ميکنند.
اندازه منافذ ژل اولا با غلظت کل منومرهاي آکريلاميد در ژل ارتباط دارد ثانيا با نسبت بيس آکريلاميد به آکريلاميد مرتبط است
nغلظت کل آکريلاميد (T) :
nاگر غلظت آکريلاميد کمتر از 5/2 درصد باشد منافذ ژل بزرگ بوده و براي غربالگري مولکول هاي درشت با وزن مولکولي 1000 کيلودالتون مناسب ميباشد و با ژل آگارز 5/0 درصد برابري ميکند اگر غلظت اکريلاميد 30 درصد باشد (با فرض اينکه بيس آکريلاميد کافي براي ايجاد پيوندهاي عرضي موجود باشد) منافذ آن کوچکترين بوده و براي غربالگري مولکول هاي با وزن 2 کيلودالتون خوب است
nنسبت بيس آکريلاميد به آکريلاميد
n: از نظر تئوري هر قدر بيس آکريلاميد نسبت به آکريلاميد بيشتر شود اتصال هاي عرضي بين پليمري زياد شده و اندازه منافذ کاهش مييابد اما مطالعات نشان ميدهد تا غلظت g/100 15 براي T بهترين حالت وقتي است که مقدارC 5 درصد است وقتي C بيشتر ميشود اتصالات عرضي به نحوي ايجاد ميشوند که بين دو پليمر مجاور فضاهاي خالي ايجاد ميشود و عملا تاثير معکوس در کاهش اندازه منافذ دارد اما وقتي T بيشتر ميشود مقدار مورد نياز بيس آکريلاميد براي رسيدن به منافذ کوچکتر بيشتر ميشود وقتي T برابر 5 درصد و C نيز 5 درصد است اندازه منافذ 20 نانومتر است.
وقتي C به بالاتر از 30 تا 50 درصد ميرسد اندازه منافذ 500 الي 600 نانومتر است (اثر معکوس).
nدر اثر SDS پلي پپتيدها بار الکتريکي منفي پيدا ميکنند که نسبت اين بار به وزن مولکول براي همه پلي پپتيدهاي موجود در نمونه يکسان است و عملا ژل SDS-PAGE با تکيه بر اندازه منافذ ژل بر اساس اندازه مولکول آنها را از هم جدا ميکند و به کار بردن مارکرهاي وزن مولکولي نيز بر اين اساس توجيه ميشود به کار بردن اوره غليظ به جاي SDS ميتواند موجب دناچور شدن پروتئين شود اما بار الکتريکي را که SDS مي بخشد جبران نميکند و لذا در اين حالت پلي پپتيدها هم بر اساس بار الکتريکي ذاتي پلي پپتيد و هم بر اساس اندازه مولکول از هم تفکيک ميشوند
nفرمول آکريلاميد و بيس اکريلاميد
nانتخاب غلظت مناسب ژل
nبراي استفاده در سيستم بافري غير دناچوره کننده (بدون SDS ) بهتر است چندين غلظت از 5 تا 15 درصد را امتحان کرد و غلظت مناسب را پيدا کرد در کار با سيستم بافري دناچور کننده SDS-PAGE نيز ميشود همين کار را کرد اما اگر وزن پلي پپتيد مورد نظر معلوم باشد با استفاده از منحني هاي موجود غلظت ژل را ميتوان حدس زده و محدوده کمتري را امتحان نمود به طور کلي با توجه به تصوير زير
nوقتي غلظت ژل 10 درصد است پلي پپتيدهاي کوچکتر از 16000 در جلوي بافر حرکت ميکنند
وقتي غلظت ژل 5 درصد است پلي پپتيدهاي کوچکتر از 60000 در جلوي بافر حرکت ميکنند
ژل از پليمرهاي آکريلاميد ساخته ميشود که داراي منافذ معيني است و اندازه اين منافذ با توجه به نياز ما بايد تنظيم شود الکتروفورز در حقيقت عبور جريان الکتريکي از بستر ژل است که پروتئين ها را مجبور ميکند بر اساس بار الکتريکي که دارند به سوي آند حرکت کنند پروتئين ها در حالت طبيعي بار منفي دارند که به توالي اسيدهاي آمينه آنها بستگي دارد ولي در اثر SDS سرتاسر مولکول به طور يکنواخت از بارهاي منفي پوشيده ميشود و فقط وزن مولکولي پروتئين به عنوان عامل تفکيک عمل ميکند پروتئينهاي با وزن مولکولي کوچکتر سريعتر از مولکولهاي درشت حرکت ميکنند
nحرکت هر پروتئين خاص (در غلظت هاي مختلف ژل) از منحني لگاريتمي خاص خود تبعيت ميکند (منحني فرگوسن) لذا اگر پروتئين مورد نظر اندازه درشتي دارد بايد اندازه منافذ ژل را بزرگتر بسازيد و برعکس اگر اندازه پروتئين مورد جستجو کوچک است منافذ با سايز کوچک لازم است .
Ferguson plot: در ژل SDS-PAGE حرکت نسبي (Rf=relative mobility) يک پلي پپتيد به صورت Log10 با غلظت هاي مختلف ژل (T) يک منحني را تشکيل ميدهد که منحني فرگوسن مينامند.
nانتخاب ضخامت و شکل ژل:
ضخامت ژل : چون حرارت در سطح ژل تعديل ميشود اما در عمق ژل تعديل حرارت تقريبا متوقف است اين اختلاف در دما بين سطح و عمق سبب ميشود پروتئين در عمق سريعتر از سطح حرکت کند و در عين حال با افزايش حرارت، حرکت مولکول ها بيشتر شده و پخش خودبخودي نيز رخ ميدهد لذا منجر به کاهش رزولوشن باند ها ميشود لذا ضخامت ژل نبايد خيلي بيشتر باشد
nشکل ژل: در مواقعي که محقق قصد دارد تا مولکول مورد نظر را تخليص کرده و اثر بيولوژيک آن را بررسي کند (نمي خواهد رنگ کند) يا ميخواهد پلي پپتيدهاي نشاندار شده با راديواکتيو را با کانتر مربوطه در برش هاي ژل جستجو کند يا وقتي مقدار نمونه بيشتري لازم است الکتروفورز شود از ژل هاي مدور حداکثر به قطر cm 6/0 استفاده ميشود به خاطر مزاياي زياد ژل هاي مسطح امروزه از ژل هاي مدور استفاده نميشود
nانتخاب pH بافر:
در SDS-PAGE با سيستم continuous از pH 3 تا 10 را ميتوان به کار برد و پروتئين پوشيده از SDS در هر حال داراي بار منفي است و حرکت خواهد داشت در pH هاي بالاتر يا پايين تر از اين محدوده هيدروليز پروتئين ها و دآميناسيون اتفاق مي افتد اما وقتي پروتئين در حالت native الکتروفورز ميشود انتخاب pH خيلي مهم است اولا pH بايد در محدوده اي باشد که پروتئين از نظر بيولوژيک غير فعال نشود ثانيا در pH ايزوالکتريک پروتئين حرکتي نخواهد داشت
nو هر قدر pH سيستم از pHI فاصله داشته باشد بار پروتئين بيشتر و حرکت آن سريعتر است
نقش stacking ژل : چون pH و بافر استفاده شده در ژل stacking اسيدي است و بافر مخزن بالايي قليائي است و چون اين ژل داراي منافذ درشتي است به محض برقراري جريان پروتئين هاي مشابه در يک رديف جمع شده و تفکيک اوليه اي در کمپلکس پروتئيني صورت ميگيرد که در نهايت منجر به رزولوشن بيشتر ميشود و به خاطر همين تفکيک اوليه اي که صورت ميگيرد
nمقدار پروتئين لود شده به ژل ميتواند بيشتر باشد بدون اينکه رزولوشن را تحت تاثير قرار دهد.
ميزان رزولوشن : براساس ضخامت باندهاي ايجاد شده تعريف ميشود هر قدر باند ايجاد شده باريک تر باشد رزولوشن بيشتر
nقدرت تفکيک : فاصله بين باندهاي ايجاد شده صرف نظر از ضخامت باندها را مي گويند.
براي بالا بردن رزولوشن : نمونه نبايد بيش از حد باشد، از سيستم discontinuous استفاده شود، يونهاي موجود در نمونه قبل از لود حذف شود
nبالا بردن تفکيک : براي بالا بردن قدرت تفکيک بين 2 پلي پپتيد مشخص غلظت خاصي از ژل بهترين است ولي امکان تفکيک يکسان براي همه پلي پپتيدهاي موجود در يک نمونه داراي کمپلکس پروتئيني غير ممکن است لذا بسته به وزن مولکولي و ساختمان پروتئين مورد جستجو غلظت مناسب ژل را بايد به طور تجربي تعيين
nتهيه ژل براي الکتروفورز
nحجم مورد نياز از ژل محلول را با استفاده از طول و عرض و ضخامت ژل مورد نظر محاسبه نموده و با استفاده از ژل غليظ ذخيره آماده ميکنيم (جدول صفحه بعد)
نکته : ابتدا صفحات شيشه اي و نوارهاي پلاستيکي فاصله ساز را با الکل 70 درجه تميز ميکنيم و بعد رويهم سوار ميکنيم و با گيره ثابت ميکنيم.
nبا ژل غليظ و زودبند يا با ژل آگارز (اگر spacer ها کمي بيرون از لبه شيشه ها باشند براحتي از بيرون با ژل آگارز ميتوان درزگيري کرد) پس از درزگيري با پي پت پاستور از ته قالب شروع کرده و ژل را ميريزيم تا 1 سانتي متر مانده به لبه شيشه کوتاه از ژل جداکننده پر ميکنيم بايد به آهستگي کار کرد تا از ايجاد حباب جلوگيري شود و بلافاصله سطح بالايي ژل را به آرامي با الکل ايزوبوتانول و يا اتانول مي پوشانيم 45 دقيقه در دماي اتاق صبر ميکنيم تا ژل کاملا پليمريزه شود اگر ژل زودتر ببندد اشکال دارد و شکننده ميشود
n(در اين لحظه ميتوان روي ژل را با بافر resolving پوشانده و تا فردا صبر کرد) بعد الکل را خالي کرده و با آب شستشو داده و بيرون ميزيزيم آب اضافي موجود را با ريختن مقدار کمي بافر stacking ميگيريم ژل استاکينگ (معمولا 4 درصد با pH = 6/6 ) را تا لبه شيشه کوتاه پر ميکنيم و بلافاصله شانه مخصوص درست کننده چاهک را در آن فرو ميبريم شانه معمولا با ژل پاييني 5/0 سانتي متر فاصله دارد 30 دقيقه صبر ميکنيم تا ژل بالايي نيز پليمريزه شود. (بسته به مقدار نمونه اي که لود ميشود و بسته به ابعاد چاهک ميتوان طول ژل stacking را بيشتر کرد اگر طول ژل stacking کم باشد رزولوشن پايين خواهد بود.

nمجموعه ژل و قالب آماده شده را در دستگاه الکتروفورز نصب ميکنيم به طوريکه شيشه کوتاه به طرف داخل قرار گيرد و با گيره هاي مخصوص در محل ثابت ميکنيم بافر را در حوضک بالايي آنقدر پر ميکنيم که به حوض پاييني نيز سرازير شود به دقت شانه را برميداريم ژل آماده نمونه گذاري است به مقدار مناسب (35 ميکروليتر ) از نمونه قبلا آماده شده به هر چاهک منتقل ميشود از مارکرهاي وزن نيز 20 ميکروليتر و معمولا در چاهک هاي طرفين ريخته ميشود
nحوضک ها از بافر کاملا پر ميشود بعد به جريان برق دستگاه وصل ميشود روي 200 ولت به مدت 40 دقيقه الکتروفورز ادامه مييابد.
مشخص کردن باندها: براي تعيين محل باندهاي ايجاد شده از رنگ کوماسي استفاده ميشود
رنگ آميزي نقره در SDS-PAGE : نقره 1 تا5 نانوگرم پروتئين را نشان ميدهد.
کوماسي بلو 40 تا 50 نانوگرم پروتئين را نشان ميدهد
nالکتروفورز ژل آگارز 
nبرای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر و اسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می گیرد. معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگتر از 500 جفت باز) در صورتیکه هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته ای و قطعات DNA تک رشته ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می شود. قدرت تفکیک ژل های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه 100 جفت باز از آگاروز 3% و برای قطعات حدود 2000 جفت باز از آگارز 8/. درصد استفاده می شو
nدر صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل همزمان با الکتروفورز استفاده می شود. به این نوع ژلها، ژل واسرشت کننده می گویند. چنین ژل هائی پیچ و تابهای اسید های نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می شود. در این ژل ها مولکولهای کوچکتر در مقایسه با مولکول های بزرگتر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می کنند. از روش PAGE برای بررسی موتاسیون ها و تعیین توالی DNA استفاده می شود.
 

nالکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار
nهر چه غلظت ژل کمتر باشد با آن می توان مولکولهای بزرگتری را بوسیلة الکتروفورز ، تفکیک کرد. ولی در این رقت محدودیت وجود دارد به طوریکه حتی با رقیقترین ژلهای آگاروز هم نمی توان مولکولهای DNA بزرگتر از 100 کیلو جفت باز را تفکیک کرد. برای این منظور از روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار استفاده می شودکه دارای انواع مختلفی است
nآ)الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار تک جهتی (UPFGE )
nیکی از ساده ترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار، روش UPFGE می باشد. برای این روش از یک دستگاه ژل الکتروفورز افقی معمولی استفاده می شود. در UPFGE ، میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین قطع شده و دوباره برقرار می شود. هنگامی که میدان برقرار است مولکول DNA بصورت گسترده در آمده و در جهت میدان حرکت می کند.
n.

. با قطع شدن جریان الکتریکی، حرکت DNA متوقف شده و DNA فرصت می یابد تا به حالت هیئت فضایی خاص خود در آید ولی با برقراری مجدد جریان حرکت مولکول آغاز می شود. در زمانی که میدان الکتریکی برقرار نیست همة مولکولها فرصت نمی کنند بطور کامل به شکل فضایی خود در آیند هر چه مولکول کوچکتر باشد سریعتر می تواند به شکل فضایی خود در آید و از آن خارج شود. براین اساس می توان مولکولهای نسبتاً بزرگ را از هم تفکیک کرد
nبا استفاده UPFGE می توان مولکولهایی تا اندازه 400 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد. از این روش الکتروفورزی در انالیز ژن های بزرک نظیر ژن کد کننده پروتئین دیستروفین که در پیدایش بیماری دیستروفی عضلانی نقش دارد، استفاده می شود.

nب)الکتروفورز در میدان الکتریکی معکوس (FIGE)
nدر روش FIGE، جهت میدان الکتریکی در فواصل زمانی معین ، معکوس می شود در این روش برای تفکیک مولکولهای کوچک از دامنه های زمانی کم استفاده می شود یعنی میدان الکتریکی بطور متناوب به مدت .5/. ثانیه در جهت مستقیم و به مدت 25/. ثانیه در جهت مخالف برقرار می شود. در مورد مولکولهای بزرگتر از زمانهای بیشتر ، 3 ثانیه به جلوو 1 ثانیه در جهت مخالف استفاده می شود. با این روش می توان مولکولهایی تا اندازه 800 کیلو جفت باز را از هم تفکیک کرد.

nژل اکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار (PFGE
nPFGEیکی از متداولترین روشهای الکتروفورز در میدان الکتریکی ضربان دار است. در این روش از دو میدان الکتریکی که نسبت بهم بصورت عمود قرار گرفته اند، در فواصل زمانی معین بطور متناوب استفاده می شود. یکی از این میدانها در جهت بالا به پائین و دیگری در جهت چپ به راست قرار دارد.
nمولکولهایDNA پس از آنکه تحت تأثیر میدان اول حرکت کردند در اثر میدان دوم 90 درجه تغییر جهت داده و حرکت می کنند. در اثر این روش مولکولهای DNA با یک حرکت چرخشی خود، در طول ژل بصورت زیگ زاگ حرکت می کنند. در روش PFGE می توان مولکولهای بسیار بزرگی در اندازه بین 20 هزار تا 2 میلیون جفت باز را از از هم تفکیک کرد.
nالکترو فورز دو بعدی
nجداسازي مخلوط هاي پروتئيني پيچيده با قدرت تفكيكي و قابليت تكرارپذير بالا, براي انجام موفقيت آميز پروتئوميكس بسيار پراهميت است. در ساليان اخير ترکيب الکتروفورز دو بعدي, طيف سنجي جرمي, و ابزار بيوانفورماتيک در مقياس بسيار وسيعي براي تحقيقات پروتئوميکس به کار گرفته شده است. با استفاده ي گسترده از الکتروفورز دو بعدي, محدوديت هاي اين روش به تدريج مشخص شده اند. اين محدوديت ها عبارتند :
nبا اين روش نمي توان پروتئوم را به طور کامل آناليز کرد. پروتئين هاي ظاهر شده  بر روي يک ژل فقط نماينده قسمتي از تمام پروتئين هاي موجود در نمونه هستند. به طور کلي آن پروتئين هايي که در ژل ظاهر مي شوند پروتئين هايي با فراواني بالا در نمونه هستند. پروتئين هايي که در تعداد نسخه هاي کم حضور دارند با روشهاي رنگ آميزي موجود نمايان نمي شوند
nعلاوه بر اين پروتئين هاي بسيار بزرگ, بسيار کوچک, بازي و پروتئين هاي هيدروفوبيک نيز در شرايط معمول آشکار نمي شوند. يکي از مشکلات اصلي در الکتروفورز دو بعدي پروتئين هاي غشايي با هيدروفوبيسيته بسيار زياد هستند که در روشهاي محلول سازي رايج به صورت محلول در نمي آيند
n دقت تعيين مقدار کمي نقاط به خصوص در رنگ آميزي نقره زياد نيست, چرا که محدوده ي ديناميک اين رنگ آميزي وسيع نبوده و همينطور خصوصيت رنگ پذيري پروتئين ها با يکديگر متفاوت است. کوماسي آبي براي اندازه گيري مقدار پروتئين ها مناسب تر است اما حساسيت آن کم است
nاتوماتيک کردن آين روش بسيار سخت است و به همين دليل روشي با ظرفيت آناليز زياد نيست .
nبراي رفع اين محدوديت ها, روشهاي ابداعي زيادي براي الکتروفورز دو بعدي ايجاد شده است. براي مثال استفاده از دترجنتهاي قوي تر, جزء به جزء کردن نمونه, استفاده از IPG  با محدوده ي pH باريک, رنگ هاي فلورسانت و حتي روباتها براي بريدن و هضم آنزيمي ژل ها. به علاوه  پيشرفتهاي زيادي نيز در ابداع و توسعة روشهايي جايگزين براي جداسازي پروتئينها در پروتئوميكس بدست آمده است, اما هنوز هيچکدام نتوانسته اند جايگزين قابل رقابتي براي الكتروفورز دوبعدي باشند. دليل اين امر خصوصيات ويژه ي اين روش است که عبارتند از
nغناي اطلاعات نهفته در داده هاي بدست آمده از الکتروفورز دو بعدي - اطلاعات مختلفي از نقاط ظاهر شده بر روي ژل الکتروفورزبدست مي آيد. از جمله نقطه ي ايزوالکتريک, وزن مولکولي و کميت نسبی آن. در ترکيب با طيف سنجي جرمي هر نقطه را مي توان تعيين هويت و ويژگي نمود. با توجه به ظهور چندين صد نقطه بر روي يک ژل به حجم زياد اين اطلاعات مي توان پي برد
nامکان جداسازي و تعيين پروتئين هايي با تغيير بعد از ترجمه - در اغلب مواقع, پروتئين هايي که بعد از ترجمه تغيير يافته اند به صورت  دسته نقاطي که به صورت يک توده عمودي يا افقي هستند در ژل الکتروفورز دو بعدي ظاهر مي شوند. اين پروتئين هاي تغيير يافته به سهولت با طيف سنجي جرمي قابل تشخيص هستند
nقابليت تفکيک زماني و مکاني مراحل آناليز پروتئوم - مي توان الکتروفورز دو بعدي  را در يک آزمايشگاه تحقيقاتي انجام داد و بعد از انتخاب نقاط پروتئيني مورد علاقه, آنها را در زماني ديگر در مرکزي خدماتي, تعيين هويت کرد. به علاوه ژلهاي خشک شده ي الکتروفورز دو بعدي را مي توان سالها نگاهداري کرد و سپس با طيف سنجي جرمي آناليز نمود. بدين ترتيب مي توان بايگاني کم حجم و پر ارزشي را در اختيار داشت
nسهولت و ارزاني نسبي � انجام آن در مقايسه با ديگر روشها از سهولت بسيار بيشتري بر خوردار است و اغلب آزمايشگاه ها با تکنيک هاي رايج الکتروفورز يک بعدي آشنايي دارند. همچنين قيمت تجهيزات و مواد در مقايسه با ديگر روشها بسيار ارزانتر است
n- کيفيت ژلهاي 2DE
nظرفيت تفكيك كنندگي ژلهاي الكتروفورز دوبعدي بستگي به طول جداسازي در هر دو بعد دارد و معمولاً متناسب با كل مساحت ژل كه درحين جداسازي در دسترس است درنظرگرفته مي شود
n-      تكرارپذيري الكتروفورزدوبعدي
nتا گذشتة نه چندان دور تكرارپذيري مشكل اصلي محدوديت استفاده گسترده از الكتروفورز دوبعدي بود . استفاده از ژلهاي لوله اي كلاسيك كه در روش اوفارل (O�ffarel) معرفي شده بود معمولاً جداسازيهاي تكرارپذير را بسيار مشكل مي كرد كه حتي اين كار در مورد يك نمونة مخصوص در داخل يك آزمايشگاه بسيار مشكل بود ، درحالي كه مقايسة جداسازي الكتروفورز دوبعدي در آزمايشگاه هاي مختلف بسيار پراهميت تلقي مي گردد. استفاده كردن از ابزار 2DE مشخص كمك شايان توجهي به حل اين مشكل نموده است. در اين وضعيت مي توان تعداد بسيار زيادي از ژلهاي 2DE را بطور همزمان انجام داد و در اين حال شرايط تكرارپذيري را قابل كنترل كرد.
nجلوگيري از ايجاد رگه هاي افقي و عمودي در ژلهاي الكتروفورز دوبعدي
nبه عنوان اصلي کلي و فراگير مي توان اظهار داشت که بروز رگه هاي افقي به علت عدم فوكوسينگ كامل و بهينه ي پروتئينها در بعد اول الكتروفورز و پديداري رگه هاي عمودي ناشي از جداسازي ناقص پروتئينها در بعد دوم الكتروفورز است
nدلیل عمده استفاده از الکترو فورز
nهزینه کمتر دستگاهی نیاز به نمونه های کوچک تر وسرعت خیلی بیشتروتفکیک بهتر از دلایل عمده استفاده از الکترو فورز ایت.
nقیمت اولیه دستگاه ومخارج نگهداری برای الکتروفورز در مقایسه با دستگاهای کروماتو گرافی یونی وطیف بینی اتمی به طور قابل توجهی پایین تر است.
nروش های الکتروفورزی در مقایسه با سایر روشها بر اساس جرم حساسترند.
nپایان
+ نوشته شده در  پنجشنبه هفتم آبان 1388ساعت 14:30  توسط esmaeil | 
www.shimi.ir/base/maint.asp - 85k
+ نوشته شده در  یکشنبه یکم دی 1387ساعت 18:6  توسط esmaeil | 
 سازي ستون كروماتوگرافي

يك بورت 50 ميلي ليتري را در حالت عمودي به گيره اي ببنديد. شير بورت بايد بسته و چرب نشده باشد. بورت را با اتر نفت (60-30 درجه ) تا نزديكي درجه 40 ميلي ليتري آن پر كنيد و به كمك يك لوله شيشه اي طويل كمي پشم شيشه را به انتهاي بورت فرو بريد. درون بروت به حدي شن بريزيد تا ارتفاع 1 سانتي متري بالاي پشم شيشه را بپوشاند. پس از خروج كامل حبابهاي درون شن، در حالي كه به آرامي به ديواره بورت ضربه ميزنيد 15 گرم آلومينا را به داخل لوله بريزيد. هنگام پايين رفتن آلومينا ستون را تكان دهيد. اين اعمال به پر شدن يكنواخت ستون كمك ميكنند. جدار داخلي بورت را كه آلومينا به آن چسبيده با اتر نفت اضافي بشوييد. براي محافظت از آلوميناي پر شده يك لايه 1 سانتي متري شن در بالاي ستون قرار دهيد. شير بورت را باز كنيد و بگذاريد تا حلال خارج شود و درست به بالاي لايه شن بالايي برسد. حال ستون براي قرار دادن نمونه مخلوط مورد تفكيك آماده است.

 

 

 

 

 

نوشته شده توسط اسماعيل نيك موضوع مطلب : کروماتوگرافی

 

يكشنبه ۸۷.۱۰.۱
کروماتوگرافی

کروماتوگرافی

کروماتوگرافی بر اصول کل پخش فاز  بنیان نهاده شده است. به طور خلاصه، در این روش جریان یک فاز از کنار (یا از داخل) فاز ساکنی میگذرد و در این حال فاز ساکن اجزای آنرا به طور انتخابی خارج میکند. این خروج یک عمل تعادلی است و مولکولهای اجزاء دوباره داخل فاز متحرک میشوند. هنگامی که ثابت پخش دو یا چند جزء در این دو فاز با هم متفاوت باشند، اجزای مربوط در فاز متحرک میشوند. هنگامی که ثابت پخش دو یا چند جزء در این دو فاز با هم متفاوت باشند، اجزای مربوط در فاز متحرک از هم تفکیک میشوند. به طور ساده میتوان گفت که هر چه فاز ساکن یک جزء را محمتر نگه دارد، در صد مولکولهای جزئی که بی حرکت نگه داشته شده بیشتر میشود. جزء دیگری که با شدت کمتر نگه داشته میشود نسبت به جزء اول در فاز متحرک درصد مولکولی بیشتری خواهد داشت. بنابراین به طور متوسط مولکولهای جزئی که با شدت کمتر نگه داشته میشوند، نسبت به مولکولهای دیگر با سرعت بیشتری از روی فاز ساکن میگذرند (در جهت جریان) و در نتیجه اجزای مربوط به قسمتهای مختلف فاز ساکن (باندها) منتقل میشوند.

فاصله باندها به طور خطی به مسافتی که در ستون طی میشود بستگی دارد. به طور کلی هر چه مسافت طی شده بیشتر باشد، فاصله باندها زیادتر خواهد شد. یادآور میشود که اجزای مخلوط باید ضرایب پخش متفاوتی داشته باشند تا بتوان آنها را به کمک پخش فاز تفکیک کرد. در صورتی که این ضرایب به هم نزدیک باشند، اجزای مربوط فقط به طور جزئی به باندهای جداگانه تفکیک میشوند. البته میتوان طول مسیر را زیاد کرد و به اجزاء فرصت داد تا بیشتر از هم جدا شوند.

کروماتوگرافی چهار نوع مهم دارد که بر اصول توصیف شده بالا متکی هستند. این انواع عبارتند از کروماتوگرافی گازی (کروماتوگرافی تفکیکی گاز مایع)، کروماتوگرافی ستونی، کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) و کروماتوگرافی کاغذی

+ نوشته شده در  یکشنبه یکم دی 1387ساعت 17:51  توسط esmaeil | 

كروماتوگرافي ستوني

در كروماتوگرافي ستوني جسم بين فازهاي مايع و جامد پخش ميشود. فاز ساكن جسم جامدي است و اين جسم اجزاي مايعي را كه از آن ميگذرد به طور انتخابي در سطح خود جذب ميكند و آنها را جدا ميكند. اثرهايي كه باعث جذب سطحي ميشوند همان اثرهايي هستند كه موجب جذب در مولكولها ميشوند. اين اثرها عبارتند از: جاذبه الكترواستاتيكي، ايجاد كمپلكس، پيوند هيدروژني، نيروي واندروالس و غيره.

براي جدا كردن يك مخلوط با كروماتوگرافي ستوني، ستون را با جسم جامد فعالي (فاز ساكن) مانند آلومينا يا سيليكاژل پر ميكنند و كمي از نمونه مايع را روي آن ميگذارند. نمونه ابتدا در بالاي ستون جذب ميشود. سپس حلال استخراج كننده اي را در داخل ستون جريان ميدهند. اين فاز مايع متحرك، اجزاي مخلوط را با خود ميبرد. ولي به علت نيروي جاذبه انتخابي فاز جامد، اجزاي مربوط ميتوانند با سرعتهاي مختلفي به طرف پايين ستون حركت كنند. تركيبي كه با نيروي كمتري جذب فاز ساكن شود سريعتر خارج ميشود زيرا كه درصد مولكولي آن در فاز متحرك از تركيبي كه با نيروي زيادتري جذب فاز ساكن ميشود بيشتر است.

اجزاي تفكيك شده را ميتوان مجددا به دو روش به دست آورد:

1) مواد جامد ستون را ميتوان خارج كرد و قسمتي از آنرا كه حاوي باند مورد نظر است بريد و با حلال مناسب استخراج كرد.

2) چون باندها با زمانهاي مختلفي خارج ميشوند ميتوان آنقدر حلال را از ستون عبور داد تا باندها از انتهاي آن خارج شوند و در ظرف جداگانه اي بريزند.

معمولا روش دوم كاربرد بيشتري دارد.

در مورد اجسام رنگين ميتوان باندهايي را كه به طرف پايين ستون مي آيند مستقيما مشاهده كرد.

 

 اما در مورد اجسام بيرنگ نميتوان تغييرات را مستقيما مشاهده كرد. با اين حال بسياري از اجسام در هنگام تابش نور ماوراي بنفش فلوئورسانس پيدا ميكنند و در چنين مواردي از اين خاصيت جهت مشاهده باندها استفاده ميشود. معمولا براي پي بردن به جريان عمل كروماتوگرافي ستوني حجمهاي كوچك و ثابتي (مثلا 25 ميلي ليتر) از محلول استخراج شده را جمع آوري ميكنند. سپس حلال آنها را تبخير ميكنند تا ببينند جسمي در آنها وجود دارد يا خير. گرچه ممكن است يك جسم در چند ظرف پخش شود، ولي اگر حجم هر جزء نسبتا كم گرفته شود (مثلا كمتر از 10% حجم ستون) معمولا باندهاي مختلف در ظروف مختلف جمع آوري ميشوند. روش ديگري كه براي پي بردن به وضع تفكيك مناسب است آن است كه محلول استخراج شده در فاصله زماني مختلف با كروماتوگرافي لايه نازك مورد بررسي قرار گيرد.

تعدادي از جاذبهاي جامدي كه عموما مصرف ميشوند عبارتند از: آلومينا، سيليكاژل، فلورسين، زغال چوب، منيزيم اكسيد، كلسيم كربنات، نشاسته و شكر. معمولا شيميدانهاي آلي از آلومينا، سيليكاژل و فلورسين بيشتر استفاده ميكنند.

آلومينا (Al2O3) تركيب قطبي بسيار فعالي است كه قدرت جذب زيادي دارد و به سه صورت موجود است: خنثي، شسته شده با اسيد و شسته شده با باز. آلوميناي بازي براي تركيبهاي اسيدي و آلوميناي اسيدي براي تركيبهاي بازي قدرت تفكيك خوبي نشان ميدهد. در تركيبهايي كه به شرايط اسيدي و بازي حساسيت دارند و واكنش شيميايي دارند بايد از آلوميناي خنثي استفاده كرد. آلومينا با قطبيت زيادي كه دارد تركيبهاي قطبي را به شدت جذب ميكند و در نتيجه ممكن است استخراج آنها از ستون را مشكل كند. فعاليت (قدرت جذب) آلومينا را ميتوان با افزايش كمي آب كاهش داد، درجه فعاليت آلومينا با درصد وزني آب موجود مشخص ميشود. سيليكاژل و فلورسين هم قطبي هستند ولي قطبيت آنها از آلومينا كمتر است.

براي اينكه جاذبهاي جامد نيروي موثر تري داشته باشند، بايد اندازه ذرات آنها يكنواخت و سطح مخصوص آنها زياد باشد. چنين سطحي باعث تسريع تعادل جسم در دو فاز ميشود. اين حالت در ايجاد باندهاي باريك اهميت دارد.

در تعيين شرايط يك تجربه كروماتوگرافي بايد به ماهيت فاز مايع (حلال) مصرفي توجه كرد. حلال نيز ميتواند در جسم جامد جذب شود و به اين وسيله براي جذب مواضع جذبي كه در سطح جامد وجود دارند، با جسم حل شده رقابت كند. چنانچه حلال قطبي تر باشد و شديدتر از اجزاي مخلوط جذب شود، تقريبا تمام اجزاء در فاز مايع متحرك باقي ميمانند و تفكيكي كه در ضمن تجربه صورت ميگيرد ناچيز خواهد بود. در نتيجه براي اين كه تفكيك خوب انجام شود بايد قطبيت حلال استخراجي به طور قابل ملاحظه اي كمتر از اجزاي مخلوط باشد. به علاوه بايد اجزاي مخلوط در حلال حل شوند، زيرا در غير اين صورت اجزا به طور دايم در فاز ساكن ستون جذب ميشوند و در آن باقي ميمانند. قدرت استخراجي حلالهاي مختلف (يعني توانايي آنها در انتقال يك جسم معين به پايين ستون) بترتيب زير از بالا به پايين زياد ميشود:

+ نوشته شده در  یکشنبه یکم دی 1387ساعت 17:50  توسط esmaeil | 

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است و اصول آن مانند کروماتوگرافی ستونی است. ولی در این مورد جسم جاذب جامد را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه یا پلاستیک محکم پخش میکنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه میگذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار میدهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد (شکل الف). حلال به طرف بالای صفحه میرود و اجزاء مخلوط را با سرعتهای متفاوت با خود میبرد. در نتیجه ممکن است تعدادی لکه روی صفحه ظاهر شود. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال ظرف قرار میگیرند (شکل ب).

 

 

این روش کروماتوگرافی بسیار آسان است و به سرعت هم انجام میشود. این روش برای تفکیک اجزاء یک مخلوط بسیار مفید است و همچنینی میتوان از آن برای تعیین بهترین حلال استخراج کننده جهت کروماتوگرافی ستونی استفاده کرد.

در TLC میتوان از همان مواد جامد که در کروماتوگرافی  ستونی استفاده میشود استفاده کرد و در این میان سیلیکا و آلومینا بیشتر به کار میرود. معمولا جسم جاذب را با مقدار کمی از ماده نگهدارنده مانند گچ شکسته بندی، کلسیم سولفات و یا نشاسته مخلوط میکنند تا جسم جاذب چسبندگی لازم را پیدا کند و به صفحه بچسبد. صفحه ها را میتوان قبل از مصرف تهیه کرد و یا از ورقه های پلاستیکی آماده که در بازار موجود است استفاده نمود.

یکی از مزایای مشخص TLC آن است که احتیاج به مقدار بسیار کمی از نمونه دارد. در بعضی موار میتوان تا مقدار 9-10 گرم را تشخیص داد. اما ممکن است اندازه نمونه تا 500 میکرو گرم برسد. در نمونه های زیاد میتوان از تجربه های تهیه ای استفاده کرد. در این تجربه ها لکه های مختلف را میتراشند و با یک حلال مناسب میشویند (استخراج میکنند). و برای شناسایی (از طریق طیف سنجی) به کار میبرند.

تشخیص لکه های رنگین در روی کروماتوگرام آسان است و برای تعیین محل لکه های اجسام بیرنگ روشهای متعددی وجود دارد. برای مثال میتوان با تابش نور ماوراء بنفش به صفحه محل لکه، ترکیبهایی را که خاصیت فلوئورسانس دارند مشخص کرد. به روش دیگر میتوان جسم جاذب را با ماده فلوئورسانس دار بی اثر دیگری مخلوط کرد. هنگامی که نور ماوراء بنفش به این صفحه بتابد، لکه اجسامی که نور ماورای بنفش را جذب می کنند ولی خاصیت فلوئورسانس ندارند در زمینه فلورسانس دار صفحه به صورت تیره رنگ ظاهر میشوند. در بسیاری موارد دیگر، از معرفهای آشکارساز دیگری استفاده میکنند. این معرفها را میتوان بر روی کروماتوگرام پاشید و لکه ها را ظاهر کرد. سولفوریک اسید، که بسیاری از ترکیبات آلی را به ذغال تبدیل میکند و محلول پتاسیم پرمنگنات نمونه هایی از معرفهای آشکار ساز هستند که به این روش مصرف میشوند. ید نیز معرف آشکار ساز دیگری است که مصرف میشود. در این مورد صفحه را دز ظرفی میگذارند که محیط آن از بخار ید اشباع باشد. بسیاری از ترکیبات آلی ید را جذب میکنند و لکه آنها روی کروماتوگرام رنگین (معمولا قهوه ای) میشود.

در شرایط معین سرعت حرکت ترکیب نسبت به سرعت پیشرفت حلال (Rf) خاصیت مشخصی از ترکیب است. برای تعیین این مقدار مسافتی را که جسم از خط شروع تا وسط لکه را طی کرده است اندازه میگیرند و آنرا به مسافتی که حلال پیموده تقسیم میکنند. این مسافت را با خط شروع یکسانی میسنجند.

 

+ نوشته شده در  یکشنبه یکم دی 1387ساعت 17:49  توسط esmaeil | 
كروماتوگرافيiran-environment.com/Uploads/File/DIOXIN.pps
+ نوشته شده در  یکشنبه یکم دی 1387ساعت 17:44  توسط esmaeil | 
+ نوشته شده در  یکشنبه یکم دی 1387ساعت 17:39  توسط esmaeil | 
 

      1.  
      2.  
      3.  

ادامه مطلب
+ نوشته شده در  پنجشنبه بیست و یکم آذر 1387ساعت 0:9  توسط esmaeil | 
 
+ نوشته شده در  پنجشنبه بیست و یکم آذر 1387ساعت 0:3  توسط esmaeil |